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                            細胞培養工藝設計實質性,高抗剪切性
                            發布日期:2023年01月11日 發布人:admin
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                            核心內容:
                            在連續攪拌槽反應器(CSTRs)中培養的多細胞生物在懸浮培養中對環境條件比微生物細胞更敏感。盡管研究表明這些細胞對剪切不那么敏感,但攪拌引起的剪切應力是主要問題的假設仍然存在。由于這些結果很大程度上是基于中國倉鼠卵巢(CHO)細胞實驗,問題是類似的行為是否適用于具有較高特異需氧量的昆蟲細胞。對高氧傳遞速率的要求與過程中較高的剪切力有關。因此,我們著重研究了昆蟲細胞的抗剪切能力。以CHO細胞為參照系統。應用了一個微流體裝置,允許剪切速率的定義變化。兩種細胞株均表現出較高的抗剪切速率,最高可達8.73 × 105?;谶@些結果,我們使用微生物CSTRs,在高轉速和低曝氣速率下操作,發現對細胞活力沒有負面影響。此外,這種培養方法大大降低了氣體的流速、氣泡和泡沫的形成,而不再需要添加純氧。因此,本研究有助于發展更穩健的昆蟲細胞培養過程。
                            我們先看一下實驗數據的分析結果,圖表2可以看出無量綱剪切相關聚集不適用于這些細胞。孵育時間和剪切速率的乘積在剪切裝置內是恒定的,因為在更高的流速下,孵育時間減少的量與剪切速率的增加相同。因此,只要流動條件保持層流,無量綱剪切是恒定的。但是,在更高的流速下,細胞的生存能力會下降。這種降低也表明當剪切速率超過維持恒定無量綱剪切的閾值時,就會發生細胞損傷。
                            接下來看一下受控剪切條件下進行的實驗,看到有三種細胞系都能承受比預期高得多的剪切速率。圖 2顯示所有細胞系都可以承受高達 5 mL/min 的流速,這分別施加了高達 8.73 × 10 5  s -1和 5.82 × 10 5  s -1 的最大和平均剪切速率(表2)。在流速為 3 mL/min 和 5 mL/min 時 TCC 的增加可歸因于細胞團塊通過剪切裝置的孔口時的分散。然而,由 于10 mL/min 流速施加的剪切降低了 TCC 和 VCC。此外,我們觀察到 VCC/TCC 比率急劇增加。然而,在較低的剪切速率下,由于細胞團塊的分散,剪切具有積極的影響;當細胞被過濾時,也會發生團塊分散。
                             
                            接下來研究人員又做了生物反應器的實驗,主要驗證之前的剪切實驗結果,可以看一下A圖和B圖,圖中TCC、VCC、viability和DO、air flow、stlrrer speed、 pure oyxgen分別表示主細胞數、活細胞數、細胞活力和溶解氧、空氣流速、攪拌器的旋轉速度、純氧。在培養過程中,感染前后(虛線)和細胞活力(三角形)的總細胞數(TCC,填充符號)和活細胞數(VCC,空心符號)計數。( B ) 顯示了溶解氧 (DO) 水平、氣流、攪拌器速度和氣流中純氧百分比的趨勢。感染的時間點由垂直粗虛線表示。在該參考實驗中,細胞以 0.5 × 106細胞/mL接種并以分批模式生長,直至達到 2 × 106細胞/mL。此時,細胞以MOI為1的桿狀病毒工作病毒原液感染,并用新鮮培養基稀釋至1.0×106 細胞/mL(圖 3A)。攪拌速度范圍為100至160 rpm,對應于416 s -1和842 s -1的最大剪切速率,曝氣速率范圍為0.2至0.5標準升/分鐘(SLPM)。結果表明,即使在細胞濃度為 1.5 × 106細胞/mL,感染后需要加入純氧,以保持溶解氧水平在30%,避免高攪拌速度。感染導致細胞生長速度下降,感染后 48 小時之后,細胞活力降低至 91.4%。

                             
                            為了在攪拌下引入更高的剪切速率,研究人員改用配備一個 Rushton 葉輪的微生物生物反應器(SR1500DLS,Eppendorf DASGIP 系統)做實驗。細胞在 500 mL 批量體積中生長,攪拌速度設置為 200 rpm (883 s -1 ),作為對應于計算的 0.07 W/kg 比功率輸入的起始值。氣流保持在恒定的 0.016 SLPM。細胞接種于 0.5 × 106 細胞/mL 并在不添加新鮮培養基的情況下以分批模式生長 72 小時。在批量運行期間細胞活力增加,細胞密度達到4.5 × 106 個 細胞/mL(圖 4A)。細胞活力不受 Rushton 葉輪產生的剪切速率的影響,甚至剪切速率以高達 270 rpm (1385 s -1 , 0.17 W/kg) 的速度運行。

                            攪拌速度為 ( A , B ) 200 rpm,逐漸增加至 270 rpm;( C , D ) 400 rpm,在 48 h 時步進到 800 rpm;( E , F) 400 rpm,在 24 小時時步進到 1000 rpm。(圖 4 C)以400rpm開始,以及一個步驟增加800轉的48小時后培養。曝氣速率設置為 0.016 SPLM 以最大限度地減少氣泡和泡沫的形成,因為在該實驗中沒有使用消泡劑。盡管與其他批次相比,接種的細胞顯示出低活力(與圖4A比較),但它們的活力在前 48 小時內從 79.6% 增加到 82%。在之前的實驗中也觀察到了這種生存力的增加(圖 4A),由此得出的結論是,由 Rushton 渦輪機以 400 rpm 提供動力的生物反應器不會影響昆蟲細胞的生存能力。在最初的 400 rpm 攪拌速度和低通氣速度下,DO 水平在最初的 48 小時內從 100% 緩慢下降到 65%,在此期間培養物達到 4.0 × 106細胞/mL的細胞密度。在 48 小時時,攪拌速度增加到 800 rpm,因此,在批次運行的最后 24 小時內,曝氣速率設置為 0 SPLM。因此,在實驗的最后幾個小時內,DO 穩步下降到 0%,由于氧氣有限,細胞開始死亡。另一次培養在 1 L 的工作體積下進行,但反應器配備了三個 Rushton 葉片,這是我們用于微生物培養的設置。24 小時后,將 400 rpm 的初始攪拌速度逐步提高到 1000 rpm(9872 s -1 , 8.54 W/kg)(圖 4)E、F)。在此變化后 24 小時,生存力最初下降了約 5%;但在達到 1000 rpm 的步驟后 48 小時,存活率下降了 71.5%。這一觀察結果可以通過高攪拌速度來解釋,這導致了液體渦流的形成,因為生物反應器中沒有安裝擋板。結果,額外的空氣通過渦流表面進入懸浮液,空氣被拉什頓元件分裂成小氣泡。因此,由于氣泡破裂,與空氣相關的細胞損傷增加。細胞無法承受這些嚴酷的條件。

                            結論:
                            根據前面實驗中產生的信息,我們在微生物生物反應器中設置了修改后的 DO 控制策略。目的是保持盡可能低的氣體流速,以最大限度地減少泡沫形成和氣泡相關的剪切力。通過將攪拌速度與氣流速率聯系起來,調整了維持 DO 的 PID 控制策略。
                            我們可以看一下圖5,實驗分成2組,一組是未感染細胞培養的過程,另外一組是感染細胞培養的過程。
                            在初始階段,葉輪速度設置為最小值(150 rpm,574 s -1, 0.03 W/kg)。然后,當 DO 水平達到 30% 的設定點時,控制器被設置為逐漸增加攪拌速度,最高可達 800 rpm。攪拌器裝有 Rushton 葉輪,L-sparger 用于分配曝氣氣體。在未感染細胞的培養過程中,攪拌速度增加到300 rpm(1622 s -1,0.23 W/kg),在指數生長期結束時,TCC為6×106 個細胞/mL。氣體流速設置為 0.03 SLPM 的最小值,但不幸的是,控制器無法保持這個精確的流速(圖 5 B、D)。在 TN42 昆蟲細胞的兩次培養中測試新的控制策略??刂破髟?( A , B ) 未感染的批次培養和 ( C , D ) 感染的批次過程中進行了測試。在這兩種情況下,起始攪拌速度均為 150 rpm,控制器增加或降低速度以將 DO 保持在 30%。同時,在 24 小時內收到病毒感染的批次中測試了相同的過程控制策略。由于感染和VLP生產,細胞生長停止(圖 5 C),但氧的消耗持續增加(圖 5 d)。此外,在感染時間點,通氣率增加到 0.06 SLPM。與感染批次的參考工藝(圖 3)相比,在此設置中,無需添加純氧,因為提高攪拌速度提供了有效的氧氣轉移。
                             為了確定由于攪拌速度增加引起的高剪切的影響,我們在工作體積為 500 mL 的 1.5 L 微生物 CSTR 生物反應器(SR1500DLS,Eppendorf)中以不同攪拌速度培養的兩個 CHO 批次之間進行了直接比較。
                            一個生物反應器(圖 6A、B)在低攪拌速度下運行,從 100 rpm 開始,曝氣速率設置為 0.03 SLPM。通過逐漸增加攪拌速度將 DO 保持在 30%,這模擬了標準的 CHO細胞 分批培養。第二生物反應器以增加的攪拌速度運行。在 200 rpm 的短暫調整階段后,攪拌保持在 300 rpm,通氣速率為 0.03 SLPM。然后,在 48 小時后,攪拌增加到 600 rpm,曝氣速率降低到 0.016 SLPM。在兩個反應器中,噴霧器向培養基補充二氧化碳以控制 pH 值。通過比較微生物生物反應器中 CHO 細胞在不同攪拌速度下的兩種培養來測試高攪拌速度的影響。( A , B ) 低攪拌速度(100 rpm)的標準分批培養;( C , D ) 具有高攪拌速度(300 步進到 600 rpm)的批處理過程。 我們發現細胞生長速率在低和高攪拌設置下幾乎相同(圖 6 A、C)。此外,在指數生長期間,活力不受高攪拌器速度的影響,在接種后約 96 小時結束。在高攪拌速度,溶解氧勿使其低于80%在整個過程(圖 6 d)。我們觀察到在穩定階段的生存能力存在差異;細胞生命力在攪拌速率越快生物反應器中下降速度越快。
                            結論:
                            研究表明 CHO 細胞可以用 Rushton 葉輪培養,參考文獻也顯示了這一點。在更高的攪拌速度下,不會損壞細胞。此外,空氣流速可以保持在最低水平,并且在整個過程中不需要添加純氧。較高的攪拌速率和較低的空氣流速,在分批培養過程中幾乎消除了泡沫;因此,無需添加消泡劑。應用這種修改后的 DO 控制策略可以使 CHO 細胞培養達到更高的細胞濃度。
                             研究中描述的剪切裝置是一種有效且簡單的工具,可將定義的剪切水平直接應用于細胞以表征其剪切敏感性。在本研究中,研究人員將剪切裝置用于昆蟲和 CHO 細胞,但它也可用于其他細胞系、病毒或 VLP,以確定臨界剪切應力。通過 Rushton葉輪 動力反應器設計在低空氣流速下通過相對較高的攪拌實現的氧氣轉移率,產生比傳統操作模式高得多的細胞密度。此外,這種設置也降低了氣體流速并避免了純氧的應用。研發的控制機制具有提高過程經濟效率的優勢,但更重要的是,懸浮液中較低的氣體體積也減少了液體表面的泡沫形成和氣泡破裂。這種現象會對細胞活力、病毒質量和產品(例如 VLP)產生積極影響。
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